La gentamicine est un antibiotique à large spectre bactéricide du groupe des aminoglycosides. Il se lie à la sous-unité 30S des ribosomes et perturbe la synthèse des protéines, empêchant la formation d'un complexe d'ARN de transport et d'information, avec une lecture erronée du code génétique et la formation de protéines non fonctionnelles; les polyribosomes se séparent et perdent la capacité de synthétiser les protéines (bactériostase).
Très efficace contre les bactéries aérobies à Gram négatif: Escherichia coli, Shigella spp., Klebsiella spp., Serratia spp., Proteus spp., Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter spp. Le médicament est également actif contre les cocci aérobies à Gram positif: Staphylococcus spp. (y compris ceux qui sont résistants à la pénicilline). Le médicament est résistant à: Neisseria meningitidis, Treponema pallidum, certaines souches de Streptococcus spp., Micro-organismes anaérobies.